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새로운 위치선택적 형광표지 기술로 
시신경 단백질-세포막 상호작용 원리 규명
- 권인찬 교수팀, 단백질과 세포막의 상호작용 이미징 위한 새로운 형광기술 개발
 
 권인찬 교수팀
(왼쪽부터) 권인찬 교수, 루카스 탐 교수, 임성인 박사, 양성태 박사
 
 
□ 한미(韓美) 공동 연구팀이 인체 내 단백질과 세포막의 상호작용 원리를 규명하는 데 도움이 될 새로운 단백질 형광표지* 기술을 개발했다. 이 기술은 세포막의 신호전달 이상(異常)으로 인한 질병에 대해 정확히 이해하고 맞춤형 신약을 개발하는 데 기여할 것으로 기대된다. 
  * 형광표지 기술: 형광(특정 파장의 빛을 흡수해 다른 파장의 빛을 내는 것)을 내는 물질을 표적이 되는 대상 물질에 결합하는 기술
 
  ∘ GIST(광주과학기술원) 신소재공학부 권인찬 교수와 미국 버지니아 주립대 생물리학과 루카스 탐(Lukas Tamm) 교수(이상 공동 교신저자)의 공동 연구팀은 비천연아미노산*과 유전자 조작 대장균을 이용해 위치선택적인 형광표지 기술을 개발했다. 
  * 비천연아미노산: 자연에 존재하지 않는 아미노산
 
□ 단백질을 형광표지하고 이미징하는 기술은 생명 유지에 필수적인 신호 전달이나 세포 내 물질 수송에서 중요한 역할을 하는 단백질과 세포막의 상호작용 방식을 연구하는 데 반드시 필요하다.  
 
  ∘ 하지만 기존 형광표지 기술은 단백질의 기능을 크게 손상시키거나 원하지 않는 위치에도 형광이 표지되는 등의 문제가 있다. 이를 해결하기 위해 원하는 위치에 보다 정확하게 형광을 표지하는 기술이 필요한 상황이다. 
 
 
                   그림1

 

[그림 1] 지질체가 결합된(Myristoylated) 리커버린의 막결합 및 분리가 칼슘이온에 의해 조절되는 것을 보여주는 그래프. 막과 결합된 것을 알려주는 형광체(NBD)를 리커버린의 막결합 부위에 가까운 곳(F23)에 결합한 후에 형광분석을 통해 단백질과 막의 결합을 분석하였다. NBD는 막에 가까이 갈수록 높은 형광을 나타내는 특징이 있어서 단백질의 막결합 및 분리를 측정하기에 매우 유용하다. 리커버린은 지질체(myristoyl group)가 결합되었거나, 결합되지 않은 두 종류가 사용되었다. (a) 지질체(Myristoyl group)N-말단기에, F23에 결합된 리커버린(mRec-F23NBD)의 경우 칼슘이온을 첨가하면 NBD는 형광이 높아지고, EGTA로 칼슘을 제거하면 형광이 감소한다. (b) 지질체(Myristoyl group)는 없고 NBD만 결합된 리커버린(Rec-F23NBD)의 경우 칼슘이온의 첨가나 제거에도 형광의 변화가 없어서 막과의 결합이 일어나지 않음을 확인하였다.

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□ 연구팀은 우선 안구의 빛 흡수와 관련한 단백질인, 지질체가 결합된(myristoylated) 리커버린*의 세포막 결합 부위 등에 유전자 조작 대장균을 사용해 클릭화학* 반응성을 가진 비천연아미노산을 도입했다. 
 
  ∘ 그 후 클릭화학 반응성을 가진 형광체를 비천연아미노산이 도입된 위치에만 결합해 형광표지 후에도 단백질(리커버린)의 기능이 그대로 유지됨을 확인했으며, 형광표지 위치를 자유롭게 바꿀 수 있었다.
  * 리커버린(recoverin): 시신경의 신호전달에 관여하는 단백질. 주로 안구 내 빛을 받는 세포에서 발견되며, 자극을 받으면 시신경의 세포막에 결합해 빛에 의한 반응에 관여함
  * 클릭화학 반응: 기존에 존재하지 않는 새로운 성질을 갖는 분자를 만들기 위해 실험자가 원하는 특정 성질의 분자들을 결합시키는 반응 
 
□ 연구팀은 이렇게 개발한 위치선택적 형광표지 기술로 리커버린(단백질)이 칼슘이온 농도 변화에 따라 세포막에 결합하거나 분리되는 ‘막결합 스위치 기능’을 지니고 있음을 밝혀냈다. 
 
  ∘ 내부 전반사(total internal reflection) 방식 형광 현미경*을 이용해 관찰한 결과, 칼슘이온의 농도가 높아지면 리커버린이 세포막과 결합해 눈에서 빛을 받는 안테나 역할을 하는 로돕신(rhodopsin)의 기능을 조절하는데, 연구팀은 바이오이미징 기법을 이용해 리커버린-세포막 결합 시 지질체 스위치가 표면으로 나와 세포막과의 결합력을 높여준다는 사실을 규명했다.
  * 전반사(全反射) : 빛이 굴절률이 큰 매질에서 작은 매질로 굴절할 때, 입사각이 임계각보다 크면 굴절하지 않고 전부 반사되는 현상 
  * 내부 전반사 방식 형광 현미경 : 빛이 전반사 조건으로 입사될 때, 매질 사이 경계면으로부터 약 200㎚ 내에 소실파 (Evanescent wave)가 유도되는데, 이 영역을 이용하여 형광 물질을 관찰하는 이미징 기법.  
 
             그림2
 
[그림 2] (c) 내부 전반사 방식 형광현미경을 사용하여 리커버린은 칼슘이온이 있을 때 막에 결합하고 칼슘이온을 EGTA로 제거해 주면 막에서 분리되는 과정을 보여주는 도식. (d) 지질체가 리커버린에서 막결합 부위인 23번째 페닐알라닌(F23) 위치에 결합된 리커버린(mRec-F23NBD)은 칼슘이온을 첨가하면, 시간에 따라 형광이 증가하였으나 Rec-F23NBD은 형광의 변화가 없었다. 사용한 형광체는 막에 결합하면 형광이 높아지는 것이라 형광의 증가는 리커버린이 막에 결합되었다는 것을 알려준다. (e) 이온제거제(EGTA)로 칼슘이온을 제거하면 NBD만 결합된 리커버린(mRec-F23NBD)의 형광이 감소했다. 이 결과는 리커버린과 막의 상호작용은 칼슘에 의해 조절된다는 것을 알려준다. (f) 칼슘이온의 도입으로 지질체(myristoyl group)가 돌출하여 막과 결합하고, 칼슘이온을 제거하면 지질체(myristoyl group)가 리커버린 안으로 숨게 되어 막과 분리되는 과정을 보여주는 도식이다. 이것이 칼슘이온에 의한 리커버린과 막과의 상호작용 기작이라고 할 수 있다. (g) 리커버린의 막결합 부위에서 먼 위치인 158번째 페닐알라닌(F158) 위치에 형광체를 결합한 경우 칼슘이온을 도입하면 막결합 부위가 가까운 23번째 페닐알라닌(F23) 위치에 도입된 경우에 비해 형광의 변화가 현저하게 적게 관찰되었다. 이 결과는 지질체가 막과 결합한다는 것을 다시 확인해 주는 것이다.  
 
            그림3
(그림 3) 칼슘이온의 첨가에 따라 형광체가 결합된 지질체가 결합된(myrisoylated) 리커버린 (mRec-F23NBD)이 막과 결합하는 것을 보여주는 광학현미경 사진. DPPC:DOPC:cholesterol이 2:2:1의 비율로 구성된 막은 Lo/Ld phase가 공존한다. Ld phase에 선택적으로 염색하는 Rh-PE 형광체(빨간색)를 사용하여 이 막이 Lo/Ld 상분리가 됨을 확인하였다 (왼쪽 사진들). 즉, 빨간색으로 염색된 부분은 Ld phase 이고 염색되지 않는 원들은 Lo phase 이다. 상단 3장과 하단 3장의 사진은 각각 칼슘이 있을 경우(상단)와 없을 경우(하단)를 광학현미경으로 분석한 사진들이다. 칼슘이 없을 경우 형광체(NBD)를 가진 리커버린이 막에 결합하지 못하여 형광(밝은 녹색)이 거의 나타나지 않는다. (상단 중앙). 그러나 칼슘이 있을 경우 형광체를 가진 리커버린이 막에 결합하여 형광(밝은 녹색)을 나타낸다 (하단 중앙). Rh-PE 형광체로 Ld phase에만 염색된 막과 리커버린의 NBD로 염색된 막의 겹친 이미지(하단 오른쪽)를 보면, 리커버린이 Rh-PE 같은 곳에 존재하여 오렌지색을 나타낸다. 즉 리커버린이 Ld phase에 주로 결합한다는 것을 보여주고 있다. 스케일 바는 10 마이크로미터를 가리킨다. 
 
□ 권인찬 교수는 “이번에 개발된 형광표지 기술은 단백질이 세포막이나 다른 생체 분자들과 어떻게 상호작용하는지를 밝히는 데 도움을 줄 것”이라며 “(궁극적으로) 세포막의 신호전달이 관계된 질병의 원인을 이해하거나 새로운 신약 개발을 하는 데 기여할 것으로 기대한다”고 말했다.
 
□ 권인찬 교수와 루카스 탐 교수가 주도하고, 미국 버지니아 주립대 생물리학과 양성태 박사와 화학공학과 임성인 박사(이상 공동 제1저자)가 수행한 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 중견연구자지원자사업과 GIST 바이오광학영상센터의 지원을 받아 수행되었으며, 세계적 권위의 과학 학술지 네이처(Nature) 자매지인 ‘사이언티픽 리포츠(Scientific Reports)’에 9월 8일자로 게재되었다.     <끝>
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